اعداد مختبر لدراسة الامراض النباتية

اعداد مختبر لدراسة الامراض النباتية:



أي مرض من الامراض النباتية التي تظهر في منطقة ما والذي لايمكن التعرف عليه وتشخيصه بسهولة في الحقل يتطلب اجراء الدراسات المختبرية كالفحص المجهري للعينات او عزل المسببات المرضية على اوساط غذائية ويجب ان يلحق بالمختبر غرفة صغيرة لاجراء العزل والتنقية والعدوى تعرف بغرفة العزل isolation room يمكن تعقيمها بواسطة مصباح الاشعة فوق البنفسجية U.V ultraviolet او تطهيرها بمواد كيمياوية كالفورمالين او الكحول المركز 100%.

اولا: الاجهزة والمعدات

1- مجهر مركب 2- ادوات اخذ العينات

3- حاضنه تستخدم لتنمية الفطريات والبكتريا ويفضل °c 0-50.

4- جهاز التعقيم البخاري outoclave.

يستخدم لتعقيم الاوساط والقطن والاطباق المراد غسلها وتنظيفها.

5- فرن لتعقيم الزجاجيات وتجفيف العينات.

ثانيا: الادوات الزجاجية

تستخدم لتحضير الاوساط الغذائية وكذلك عزل وتنمية الكائنات المرضية مثل انابيب الاختبار, اطباق بتري , دوارق , سلندر , ماصة .



طرق دراسة الامراض النباتية:

المرض ظاهرة فسيولوجية قد يحدثها عامل او اكثر من عوامل البيئة او نتيجة اصابة النبات بكائنات حية متطفلة فتسبب ضعف النبات المصاب جزئيا او كليا وقد يؤدي الى موته.

ولدراسة أي انحراف يظهر على النبات تستلزم دراسة المرض في مكان ظهوره ثم دراسته مختبريا.

اولا: دراسة المرض في مكان ظهوره

تدرس الاعراض المرضية الظاهرة التي يظهرها المسبب المرضي على النبات في الحقل ويشخص احيانا بدون دراسة مختبرية في مكان ظهوره وغالبا يستلزم الخبره في التشخيص.

ثانيا: لدراسة المرض مختبريا يجب اخذ العينات المرضية وكذلك يجب الالمام بطرق اخذ العينات والنماذج المرضية.

1- قد يتطلب اخذ النبات المريض بكامله مع جزء من التربة حول الجذور.

2- اخذ الجزء المصاب اذا كان مجموع خضري او ثمار.

3- تفحص باسرع وقت ممكن وتحفظ في الثلاجة لحين الفحص والدراسة .



تحضير الشرائح ودراستها:

يعتمد التعرف على الامراض النباتية بدراسة الاعراض الظاهرية في بادئ الامر ثم الفحص المختبري بعدها يتم عمل شرائح للفحص المجهري ومن هذه الطرق:

1- عمل سلخ stripping

يعمل سلخ لبشرة الجزء المصاب بما عليه من نمو فطري وتستعمل هذه الطريقة في فحص الحوامل الجرثومية ومعرفة اذا كان نمو الطفيلي سطحي (البياض الدقيقي) او داخلي مثل البياض الزغبي. يعمل سلخ بعمل شق عميق في بشرة الجزء المصاب بواسطة شفرة حادة ثم تمسك طرف البشرة عند حافة الشق بواسطة ملقط رفيع مدبب.

2- عمل كشط scrapping

ياخذ جزء من نمو الطفيلي الخارجي بدون أي جزء من انسجة العائل وبواسطة ابرة او شفرة ثم يفرد في وسط التحميل المستعمل ويغطى بغطاء الشريحة وتستعمل في نمو الفطريات التي تنمو سطحيا على العائل مثل الفطريات المسببة للبياض الدقيقي وفحص امراض الاصداء والتفحمات.

3- السحق والتمزيق crushing and tearing

تسحق الانسجة المحتوية على نمو الطفيلي او يسحق الطفيلي نفسه لتحرير مكوناته كالاجسام الثمرية باستعمال قاعدة الابرة مثل الضغط عليه بالغطاء الزجاجي.

4- عمل القطاعات sectioing

تستخدم شفرة نظيفة حادة لعمل قطاعات عرضية وطولية في الاجزاء المصابة.



الاوساط الزرعية المغذية:

يتطلب لعزل المسببات المرضية الفطرية والبكتيرية ودراستها من الناحيتين المظهرية والتشريحية توفير متطلبات غذائية يحتاجها الفطر لنموه وتطوره تكون الاوساط الفطرية متعادلة اومائله الى الحوضة اما الاوساط البكتيرية فيكون الاس الهيدروجيني مائل الى القاعدية



الاوساط الزرعية الفطرية : هنالك ثلاثة اوساط مستخدمة في تنمية الفطريات هي

1- الاوساط الزرعية الطبيعية natural media

هي مستخلصات نباتية او حيوانية غير معروفة التركيب كما ونوعا وتحضر من الانسجة النباتية ( اوراق، سيقان ، جذور، بذور، ثمار) تمتاز بانها تماثل في تركيبها الوسط الذي ينمو عليه الفطر في الطبيعة معظم الفطريات تنمو وتتجرثم على هذه الاوساط منها البطاطا، الخضروات. مثال وسط اكر البطاطه potato agar media

2- الاوساط التركيبية synthetic media

تتكون من مواد عضوية وغير عضوية معروفة التركيب ويراعى ان تشابه قدر الامكان تركيب الانسجة والاعضاء النباتية التي تنمو عليها الفطريات ويراعى قياس درجة الحموضة ph من امثلتها وسط براون Brown .

3- الاوساط نصف التركيبية semi synthetic media

خليط من النوعين السابقين لاحتوائها على واحد او اكثر من المواد الطبيعية غير معروفة التركيب اضافة الى مركبات معروفة التركيب.



اشكال الاوساط الفطرية:

توجد اشكال مختلفة للاوساط الغذائية الفطرية المستعمله منها:

1- الاوساط الصلبة solid media

عبارة عن الانواع الثلاثة السابقة مضافا اليها مادة الاكر بنسبة 15-20 غم لكل لتر من الوسط الغذائي فيؤدي الى تصلب الوسط وتتحول تلك الاوساط الى الحالة السائلة بالحرارة وتتصلب بالبرودة .وتستخدم في عزل وتنقية الفطريات والبكتريا ,وتستخدم الاوساط الصلبة اما في انابيب اختبار او اطباق بتري.

2- الاوساط السائلة Liquid media

نفس الاوساط السابقة لكن بدون اضافة الاكر تستعمل في الاستخدامات الدقيقة الخاصة بالتغذية وافراز الانزيمات وتستعمل الاوساط السائلة في دوارق مخروطية مختلفة الاحجام.

3- بعض الاوساط الغذائية الخاصة

بعض الفطريات الطفيلية تنمو وتتجرثم بسهولة وبكثرة على الاجزاء النباتية المعقمة ومنها:

أ‌- استخدام بذور او حبوب النبات العائل حيث تعقم بجهاز التعقيم وتلوث بالفطر المراد تنميته.

ب‌- استخدام اجزاء بطول 1سم من القش المعقم لاي نبات بقولي او نجيلي ونثرها على سطح الوسط الغذائي النامي عليه الفطر في الاطباق لتشجيع تجرثمه ونموه.

ت‌- عند دراسة فطريات التربة تستخدم حبيبات التربة بوضعها في انابيب ذات اطوال مناسبة ثم تحقن بالفطريات لدراستها.

ث‌- استخدام ثمار بعض الخضروات والفاكهه حيث يمكن استخدام ثمار الخيار كوسط غذائي لتنمية انواع من فطريات ال pythium و phytophthora وكذلك ثمار التفاح والبرتقال غير الناضجة حيث يمكن ان تستخدم لعزل وتنمية كثير من الفطريات حيث يعقم سطحها بالكحول او الكلور لمدة دقيقتين ثم تغسل بالماء المقطر المعقم ويلقح بالفطر المراد تنميته.



تعقيم الاوساط الغذائية:

تعقم الاوساط الغذائية بعد تحضيرها في الدوارق او الانابيب في جهاز التعقيم بالبخار autoclave وذلك لقتل كل الكائنات الحية حيث توضع الاوساط في الجهاز ويغلق باحكام ويبدا الضغط داخل الجهاز بالارتفاع تدريجيا وعند وصول الضغط الى 15 باون/انج² والحرارة الى 121م° يترك الجهاز لمدة 20 دقيقة ثم يقطع مصدر التيار الكهربائي تفتح فتحة البخار لكي يتسرب البخار تدريجيا ثم يفتح غطاء الجهاز.



عمل الاكار المائل:

يحضر الوسط المائل كما في الطريقة السابقة حيث يوضع 3-5 ملي لتر في انبوبة اختبار وتغلق وتعقم ثم توضع على المنضدة في وضع مائل ويترك ليبرد وتستعمل هذه الطريقة في تجديد وحفظ العزله الفطرية.



طرق عزل وانماء الفطريات

تعقم الاجزاء النباتية في كثير من الاحيان تعقيما سطحيا باستعمال احد المحاليل مثل كلوريد الزئبقيك 0.001 او هايبو كلورات الصوديوم 0.35% او فورمالين او كحول 70%.

تغمر الاجزاء النباتية المصابة في محلول التعقيم ثم تغسل الاجزاء النباتية بالماء المقطر المعقم عدة مرات للتخلص من اثار المحلول المعقم.



الحصول على مزارع نقية من الفطر pure culture

افضل طريقة للحصول على مزرعة نقية هي طريقة الجرثومة الفردية single spore وكذلك تعرف بطريقة التخافيف Dilution method :

يتطلب تحضير عدة انابيب اختبار معقمة يوضع في كل منها 9 مل ماء مقطر معقم وتعمل تخفيفات من معلق الجراثيم المراد عزلها حيث تاخذ أقراص قطر 0.5 سم بثاقب الفلين وتعمل لها سلسلة تخافيف وذلك بخلطها مع 9 مل من الماء المقطر المعقم ثم ترج جيدا ثم يؤخذ منها 1مل ليخلط مع 9 مل من الماء المقطر المعقم وعملت سلسلة من التخافيف للوصول إلى التخفيف المطلوب ثم يوضع 1مل من التخفيف الأخير في طبق بتري ويضاف إليه الوسط الغذائي P.D.A المحضر سابقاً وبمقدار 20 سم³ /طبق ، ثم حركت الأطباق حركة رحوية لتجانس العالق مع الوسط الغذائي ، وتحضن الأطباق في الحاضنه وبعد 24 ساعة حسب سرعة انبات جراثيم الفطر تعد المستعمرات الظاهرة ثم تحسب أعداد الوحدات التكاثرية.